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CRISPR amplía las posibilidades de las células CAR T
A medida que crece el interés en la inmunoterapia, también crece la necesidad de mejores herramientas para diseñar células CAR T. ¿Podrían los avances en la tecnología CRISPR ser la solución?
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En la última década ha entrado en la clínica una nueva herramienta de inmunoterapia. Se ha demostrado que las células T diseñadas para expresar receptores de antígenos quiméricos, conocidas como células CAR T, ayudan a los pacientes con cáncer de la sangre. Un estudio fundamental 1 realizado en 2011 utilizó células CAR T de segunda generación para lograr una activación y una remisión sostenidas de las células T en la mayoría de los pacientes analizados.
Un año más tarde se produjo otro gran avance, ya que dos grupos describieron 2 , 3 una nueva herramienta de edición de genes llamada CRISPR-Cas9 y demostraron su uso en células eucariotas. Estos dos informes ayudaron a iniciar una nueva era en la edición de genes.
Aunque la edición de genes tenía el potencial de mejorar la ingeniería celular, pasarían varios años antes de que las células CAR T y CRISPR se cruzaran.
Encontrar el camino
Desde el principio, las células CAR T mostraron un gran potencial para matar el cáncer, pero generar estas células fue engorroso y complicado.
Inicialmente, la ingeniería de células T dependía de vectores lentivirales o retrovirales para entregar fragmentos de ADN en una célula para la recombinación homóloga. Los vectores virales permiten la integración estable de fragmentos de ADN y la expresión a largo plazo. Sin embargo, los reactivos de grado clínico necesarios para obtener estos vectores son costosos y los vectores solo pueden transportar una cantidad limitada de ADN que tiene el potencial de integrarse aleatoriamente en el genoma.
Para avanzar en la terapia de células CAR T, los investigadores necesitaban encontrar una forma más eficiente de diseñar secuencias CAR largas.
CRISPR conduce el COCHE
Desde el principio, CRISPR parecía una forma ideal de diseñar una célula T. Es un proceso simple, con efectos secundarios mínimos y funciona en una amplia gama de tipos de células. Pero hay un área en la que CRISPR ha tenido problemas.
CRISPR-Cas9 es eficaz para generar pequeñas mutaciones mediante la creación de roturas específicas de ADN de doble cadena (dsDNA) que luego son reparadas por la vía de unión final no homóloga de la célula. Sin embargo, cuando se trata de insertar ADN exógeno utilizando mecanismos de reparación dirigidos por homología, la edición CRISPR puede ser lamentablemente ineficiente. Sin embargo, la inserción de ADN es crucial para diseñar células CAR T.
“Easi-CRISPR es una herramienta mucho mejor cuando se trata de reparación dirigida por homología”, dice Channabasavaiah Gurumurthy, ingeniero genético del Centro Médico de la Universidad de Nebraska en Omaha, quien co-inventó Easi-CRISPR en 2017.
Gurumurthy y sus colaboradores descubrieron que, cuando se trata de utilizar CRISPR para insertar ADN en una célula, el ADN monocatenario largo (ADNss) es una plantilla más eficaz que el de cadena doble. Con Easi-CRISPR, se inyecta ssDNA largo junto con un complejo preensamblado que contiene Cas9 y ARN guía, lo que da como resultado tasas más altas de edición en el objetivo y tasas más bajas de edición fuera del objetivo 4 . Junto con los informes anteriores que mostraban ARN de guía única (sgRNA) sintetizados químicamente con modificaciones en los extremos de 2′ – O -metilo y fosforotioato que mejoraron la estabilidad intracelular y la eficiencia de edición en las células primarias 5 , comenzaba a parecer que CRISPR-Cas9 podría ser una herramienta eficaz para generando tanto deleciones como inserciones dentro de las células T.
Todo se unió el año pasado cuando Alexander Marson, Gurumurthy y sus colegas usaron Easi-CRISPR para reprogramar la estructura y función de las células T humanas sin necesidad de vectores virales 6 . Este estudio demostró que la edición CRISPR de células T usando ssDNA como plantilla de reparación dirigida por homología fue más precisa y eficaz para la inserción de genes grandes, con menos integración fuera del objetivo, que las plantillas de dsDNA.
Facilitando el futuro
Aunque prometedor, había una consideración importante. «Las secuencias largas de ssDNA son difíciles de producir en el laboratorio, especialmente en las altas concentraciones necesarias para los experimentos de edición de genes», dice Theodore Roth, miembro del laboratorio de Marson y primer autor del estudio 6 .
Varias compañías y desarrolladores académicos están tratando de resolver este problema, trabajando en métodos para generar efectivamente grandes cantidades de ssDNA largo. GenScript, una empresa global de biotecnología con sede en Piscataway, NJ, conocida por sus tecnologías líderes de síntesis de ADN, recientemente comenzó a proporcionar ssDNA de varios miles de nucleótidos de largo, en cantidades de hasta 100 microgramos, ideal para la reprogramación de células T mediante CRISPR. GenScript es también una de las pocas empresas que ofrece soluciones CRISPR totales, incluidos sgRNA sintetizados químicamente y purificados por HPLC con modificaciones finales para mejorar la edición CRISPR.
La edición de genes está cambiando la forma en que los investigadores abordan la ingeniería celular. Los métodos como Easi-CRISPR, junto con las mejoras en la síntesis de ADN y ARN, están preparados para mejorar aún más los esfuerzos de ingeniería de células CAR T y, en última instancia, mejorar la terapia contra el cáncer y la salud humana.
Para obtener más información sobre el uso de Easi-CRISPR para reprogramar las células T, vea este seminario web gratuito de Theo Roth, el primer autor de la ref. 6.
Haga clic aquí para obtener más información sobre cómo el nuevo servicio ssDNA de GenScript puede ayudar con la ingeniería CAR T efectiva.
Referencias
- Porter, DL, et al. N Engl J Med 365 , 725–733 (2011).Artículo Google Académico
- Jinek, M., et al. Ciencia 3337 , 816–812 (2012).Artículo Google Académico
- Cong, L., et al. Ciencia 339 , 819–823 (2013).Artículo Google Académico
- Miura, H., et al. Protocolo Nat. 13 , 195–215 (2018).Artículo Google Académico
- Hendel, A. et al. Nat. Biotecnología. 33 , 985-989 (2015).PubMed Artículo Google Académico
- Roth, TL, et al. Naturaleza 559 , 405–409 (2018).PubMed Artículo Google Académico
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